Афінна хроматографія в медицині: особливості та застосування

Хроматографія-це один з методів поділу речовин. Вона використовується для подальшого якісного і кількісного аналізу фізичних і хімічних властивостей мікрочастинок. Різновидом даної технології є афінна хроматографія. Ідея диференціації білкових сполук з використанням властивості спорідненості молекул відома в науці вже кілька десятиліть. Однак свій розвиток вона отримала тільки в останні роки, після того, як були впроваджені високопористі гідрофільні матеріали, що використовуються в якості матриці. Даний метод дозволяє вирішувати як аналітичні завдання (поділ речовин і їх ідентифікація), так і препаративні (очищення,концентрування) .

Сутність

Афінна хроматографія (від латинського слова affinis – «суміжний», «споріднений») заснована на афінних взаємодіях, які являють собою утворення високо специфічних зв`язків між молекулою-роздільником (лігандом або афінантом) і цільової молекулою. Ці механізми широко поширені в природі (зв`язок медіаторів або гормонів і рецепторів, антитіл і антигенів, гібридизація полінуклеотидів та інші види процесів). У медицині афінна хроматографія почала застосовуватися в практичних цілях починаючи з 1951 р.

Поділ компонентів відбувається наступним чином:

• робочий розчин, що містить речовину, яку необхідно виділити, пропускають через сорбент;
• ліганд, нанесений на матрицю-сорбент, утримує цю речовину;
• відбувається його концентрування (накопичення);
• Витяг виділеної речовини з сорбенту за допомогою вимивання розчинником.

Даний спосіб дозволяє виділити цілі клітини. Відмінністю від традиційної сорбційної хроматографії є те, що існує міцне біоспецифічне зв`язування виділяється компонента з сорбентом, що характеризується високою вибірковістю.

Адсорбент

Як адсорбентів застосовують наступні речовини:

• Гелеподібні склади на основі агарози-полісахариду, одержуваного з агару. Найбільш часто використовують 3 різновиди: сефарозу 4 В, CL (зшита агароза) і аффі-гель. Останній склад являє собою модифікований гель з агарози і поліакриламіду. Він має більшу біологічну інертність, високу хімічну та термічну стійкість.
• Кремнезем (силікагель).
• Стекла.
• Органічні полімери.

Для усунення механічних перешкод при контакті ліганду застосовують додаткові речовини, що відокремлюють його від носія (пептиди, діаміни, поліаміни, олігосахариди).

Апаратура

Обладнання для афінної хроматографії включає до свого складу наступні основні вузли:

• ємності-накопичувачі для рухомої фази (елюента);
• насоси високого тиску для подачі середовища (найчастіше поршневі);
• фільтр для очищення елюентів від пилу;
• дозуючий пристрій;
• хроматографічна колона для розділення суміші;
• детектор для визначення розділених компонентів, що виходять з колони;
• реєстратори хроматограм і мікропроцесорний блок (ЕОМ).

З метою зменшення кількості розчиненого повітря через рухому фазу попередньо пропускають гелій. Для зміни концентрації елюента встановлюють кілька насосів, керованих програматором. Хроматографічні колони виготовляються з нержавіючої сталі (при підвищених вимогах до корозійної стійкості), зі скла (універсальний варіант) або з акрилу. Для препаративних цілей їх діаметр може коливатися від 2 до 70 см. В аналітичній хроматографії застосовують мікроколонки Ø10 - 150 мкм.

Для підвищення чутливості детекторів в суміш вводяться реагенти, які сприяють утворенню речовин, які більше поглинають промені в ультрафіолетовій або видимій області спектра.

Методика проведення

Розрізняють 2 основних види рідинної афінної хроматографії:

• Колоночная, при якій колону заповнюють нерухомою фазою і через неї пропускають суміш з потоком елюента. Поділ може відбуватися під тиском або під в результаті дії сили тяжіння.
• Тонкошаровий. Елюент рухається по плоскому шару адсорбенту під впливом капілярних сил. Адсорбент наносять на пластину зі скла, керамічну або кварцову паличку, металеву фольгу.

Основний етапи робіт включають в себе:

• підготовка адсорбенту, фіксація ліганду на носії;
• подача суміші для поділу в хроматографічну колону;
• завантаження рухомої фази, зв`язування компонента лігандом;
• Заміна фази для виділення пов`язаної речовини.

Призначення

Афінна хроматографія використовується для виділення наступних видів речовин (в дужках вказано вид застосовуваного при цьому ліганду):

• аналоги ферментативних інгібіторів, субстратів і кофакторів (ферменти);
• біоорганічні речовини, що володіють ознаками генетичної чужорідності, віруси і клітини (антитіла);
• високомолекулярні вуглеводи, полімери моносахаридів, глікопротеїни (лектини);
• ядерні білки, нуклеотидилтрансферази (нуклеїнові кислоти);
• рецептори, транспортні білки (вітаміни, гормони);
• білки, що взаємодіють з клітинними мембранами (клітини).

Ця технологія також використовується для отримання іммобілізованих ферментів, а прив`язка їх до целюлози дозволяє виготовити імуносорбенти.

Хроматографія ДНК-зв`язуючих білків

Виділення ДНК-зв`язуючих білків проводиться за допомогою гепарину. Цей глікозаміноглікан здатний зв`язувати великий діапазон молекул. Афінна хроматографія білків цієї групи використовується для виділення таких речовин, як:

• фактори ініціації та елонгації трансляції (синтез молекул нуклеїнових кислот і білків);
• рестриктази (ферменти, які розпізнають певні послідовності в ДВОЛАНЦЮЖКОВІЙ ДНК);
• ДНК-лігази і полімерази (ферменти, що каталізують з`єднання двох молекул з утворенням нової хімічного зв`язку і беруть участь в реплікації ДНК);
• інгібітори серинових протеаз, які відіграють важливу роль в імунних і запальних процесах;
• фактори росту: фібробластів, Шванна, ендотеліальний;
• білки міжклітинного матриксу;
• рецептори гормонів;
• ліпопротеїд.

Гідність

Даний метод є одним з найбільш специфічних для виділення реакційноздатних сполук (ферментів і більших агрегатів-вірусів). Однак він використовується не тільки для виділення біологічно активних речовин.

Виявлення антитіл в малих кількостях, кількісна оцінка поліаденілової кислоти, експрес-визначення молекулярних мас дегідрогеназ, видалення певних забруднювачів, вивчення кінетики активації неактивної форми трипсину – молекулярної будови інтерферонів людини-ось далеко не весь перелік досліджень, при яких застосовується аффинная хроматографія. Застосування в клініці обумовлено такими її перевагами, як:

• Можливість ефективного очищення білків, полісахаридів, нуклеїнових кислот. Вони незначно відрізняються за своїми фізико-хімічними властивостями і втрачають активність при гідролізі, денатурації та інших видах впливу, використовуваних в інших методах.
• Швидкість поділу речовин, динамічний характер процесу.
• Відсутність необхідності спеціального очищення ферментів та гомогенізації ізоферментів для визначення констант дисоціації.
• Можливість поділу широкого кола речовин.
• Невеликий витрата лігандів.
• Можливість поділу речовин у великих обсягах.
• Оборотний процес зв`язування біологічних макромолекул.

Дану методику можна поєднувати з іншими, накладати додаткове поле (гравітаційне, електромагнітне) . Це дозволяє розширити технічні можливості хроматографії.

Ферментна інженерія

Завдяки цьому методу почався активний розвиток нової галузі біотехнологій-ферментної інженерії.

Афінна хроматографія стосовно виділення ферментів володіє наступними перевагами:

• отримання ферментів у великих кількостях в результаті менших витрат часу – як результат - їх здешевлення;
• іммобілізація ферментів дозволяє значно розширити область їх застосування в медицині і промисловості;
• зв`язок ферментів з нерозчинною твердою підкладкою дає можливість вивчити вплив мікросередовища та напрямок реакцій, які відіграють важливу роль у природних та фізіологічних процесах.