Застосування реакції фогеса-проскауера для мікробіологічної диференціації ентеробактерій

У диференціальному визначенні ентеробактерій і деяких вібріонів особливе місце займає реакція Фогеса-Проскауера. Тест заснований на здатності бактерій ферментувати глюкозу з утворенням ацетоїну.

Сутність процесу дослідження

У мікробіології реакція Фогеса-Проскауера часто застосовується для диференціації всередині сімейства ентеробактерій ієрсиній (в тому числі і збудників псевдотуберкульозу і ентероколітів), кишкових паличок, спороутворюючих аеробів. Результат візуалізується за рахунок колірного фарбування середовища при додаванні певних реагентів.

Даний тест відноситься до серії IMViC (абревіатура Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer I Citrate) - групі ідентифікаційних тестів, що включають диференціальні визначення:

• з індолом, заснованим на розщепленні триптофану в індол, використовується в присутності реагенту Ковача або Ерліха;
• із застосуванням метилрота, або метилового червоного, що виявляє заданий pH в результаті метаболізування глюкози;
• реакції Фогеса-Проскауера на виявлення ацетил-метилкарбінолу;
• утилізації цитрату з зміною кольору в результаті ощелачивания середовища.

Сутність процесу-візуалізація присутності діагностованих бактерій за рахунок взаємодії ацетоїну, утвореного ними, з їдким калі в присутності кисню. Відбувається окислення ацетил-метилкарбінолу до діацетилу, який утворює сполуку яскраво-червоного або рожевого кольору. Підвищують чутливість тесту введенням альфа-нафтолу до внесення їдкого калі.

Постановка тесту

Постановка реакції Фогеса-Проскауера передбачає попереднє культивування мікроорганізмів. Чиста культура висівається на диференційно-діагностичну середу Кларка, варіація якої-бульйон Кларка (без додавання агар-агару). Використовується або готове середовище, або приготоване самостійно. Склад включає:

• 5 г пептона;
• 5 г глюкози;
• 5 г двоосновного фосфату калію;
• 1 л дистиляту.

В ході дослідження проводиться посів культури стерильною бактеріологічною петлею в рідке середовище. Кількість-5 мл в пробірці плюс контроль. Інкубація здійснюється при температурі 35-37 градусів протягом двох діб. Далі поетапно проводять дослідження реакції Фогеса-Проскауера:

1. 2,5 мл культури на бульйоні переносять в стерильну пробірку.
2. Вносять шість крапель альфа-нафтолу (5%-ний спиртовий розчин).
3. Додають 40% - ний розчин їдкого калі в кількості 0,1 мл, або дві краплі.
4. Перемішування здійснюють обережним струшуванням пробірки.
5. Оцінюють результат після 15 хвилин від початку експерименту.

Альтернативний метод проведення тесту-нічна інкубація, час якої скорочують до 18 годин або до доби. Крім такого методу застосовують також експрес-тест: вносять петлею в 2 мл середовища культуру, інкубують близько чотирьох годин, далі додають реагенти в рівній кількості 2-3 крапель, перемішують і оцінюють підсумок через десять хвилин.

Контролем виступає один із збудників пневмонії Klebsiella pneumoniae-штам atcc 13883.

Оцінка результату

Після закінчення необхідного часу після додавання реактивів (від 5 до 15 хвилин) повинна спостерігатися вишнево-червоне забарвлення при яскраво вираженій позитивній реакції, червона і рожева - при слабкій позитивній. Відсутність змін реєструють як негативний результат.

Надлишок їдкого калі в розчині може давати імітацію позитивної реакції, фарбуючи в мідний колір. В цьому випадку слід фіксувати негативну відповідь тестованої колонії. Також мідне фарбування з`являється у випадках, коли оцінка дається через годину після введення реагентів.

При оцінці результату необхідно враховувати, що тривале культивування досліджуваних мікроорганізмів (понад три доби) веде до закислення середовища, що може привести до некоректного результату дослідження. Реакція може бути слабо вираженою позитивною або хибнонегативною.

Вимоги до реагентів для тесту

Реагенти для проведення реакції Фогеса-Проскауера повинні відповідати вимогам, таким, як правильна концентрація, високий ступінь очищення і стабільність, яка досягається за допомогою дотримання правил зберігання.

Готові набори для тіста містять, як правило, реагенти на 100 і більше застосувань і знаходяться в пластикових або затемнених скляних флаконах. Якість регулюється відповідною документацією.