Рекомбінантна днк: опис, характеристики

Рекомбінантна ДНК-це молекули, утворені лабораторними методами генетичної рекомбінації для об`єднання генетичного матеріалу з багатьох джерел. Вона можлива тому, що молекули ДНК всіх організмів мають однакову хімічну структуру і відрізняються тільки нуклеотидної послідовністю в її межах.

Створення

Молекулярне клонування-це лабораторний процес, який використовується для створення рекомбінантної ДНК. Це один з двох найбільш широко використовуваних методів, поряд з полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР). Це дозволяє контролювати реплікацію будь-якої конкретної послідовності ДНК, обраної експериментатором.

Існує дві фундаментальні відмінності між методами рекомбінантної ДНК. Одним з них є те, що молекулярне клонування передбачає реплікацію в живій клітині, а ПЛР-у пробірці. Інша відмінність полягає в тому, що перший метод дозволяє вирізати та вставляти послідовності ДНК, а другий посилюється шляхом копіювання існуючої послідовності.

Вектор ДНК

Отримання рекомбінантної ДНК вимагає клонування вектора. Він походить від плазмід або вірусів і є відносно невеликим сегментом. Вибір вектора для молекулярного клонування залежить від вибору організму-господаря, розміру клонованої ДНК і від того, чи повинні експресуватися чужорідні молекули. Сегменти можуть бути об`єднані за допомогою різних методів, таких як клонування рестриктази / лігази або збірки Гібсона.

Клонування

У стандартних протоколах клонування включає сім етапів.

1. Вибір організму-господаря та вектора клонування.
2. Отримання ДНК-вектора.
3. Формування клонованої ДНК.
4. Створення рекомбінантної ДНК.
5. Введення її в організм господаря.
6. Відбір організмів, що її містять.
7. Вибір клонів з бажаними вставками ДНК та біологічними властивостями.

Після трансплантації в організм господаря чужорідні молекули, що містяться в рекомбінантній конструкції, можуть експресуватися або не експресуватися. Експресія вимагає реструктуризації гена для включення послідовностей, необхідних для виробництва ДНК. Вона використовується трансляційним апаратом господаря.

Як працює

Рекомбінантна ДНК працює, коли клітина-хазяїн експресує білок з рекомбінантних генів. Експресія залежить від оточення гена набором сигналів, які забезпечують інструкції для його транскрипції. Вони включають промотор, зв`язування рибосоми та Термінатор.

Проблеми виникають, якщо ген містить інтрони або сигнали, які діють як термінатори для бактеріального господаря. Це призводить до передчасного припинення. Рекомбінантний білок може бути неправильно оброблений, згорнутий або підданий розкладанню. Його виробництво в еукаріотичних системах зазвичай відбувається в дріжджах і ниткоподібних грибах. Використання тваринних клітин утруднено через те, що багатьом потрібна міцна опорна поверхня.

Властивості організмів

Організми, що містять рекомбінантні молекули ДНК, мають явно нормальні фенотипи. Їх зовнішній вигляд, поведінка та метаболізм зазвичай не змінюються. Єдиний спосіб продемонструвати наявність рекомбінантних послідовностей-це дослідити саму ДНК за допомогою тесту полімеразної ланцюгової реакції.

У деяких випадках рекомбінантна ДНК може мати шкідливий вплив. Це може статися, коли її фрагмент, що містить активний промотор, розташовується поруч з раніше мовчазним геном клітини-хазяїна.

Використання

Технологія рекомбінантної ДНК широко використовується в біотехнології, медицині та дослідженнях. Її білки та інші продукти можна знайти практично в кожній Західній аптеці, ветклініці, кабінеті лікаря, медичної або біологічної лабораторії.

Найбільш поширеним застосуванням є фундаментальне дослідження, в якому технологія важлива для більшості сучасних робіт в біологічних і біомедичних науках. Рекомбінантна ДНК використовується для ідентифікації, картографування та послідовності генів, а також для визначення їх функції. Зонди рДНК використовуються для аналізу експресії генів в окремих клітинах і в тканинах цілих організмів. Рекомбінантні білки використовуються як реагенти в лабораторних експериментах. Деякі конкретні приклади наведені нижче.

Рекомбінантний хімозин

Знайдений у сичузі, хімозин є ферментом, необхідний для виробництва сиру. Це була перша генетично модифікована харчова добавка, що використовується в промисловості. Мікробіологічно продукований рекомбінантний фермент, структурно ідентичний ферменту, отриманому від теляти, коштує дешевше і виробляється у великих кількостях.

Рекомбінантний людський інсулін

Практично повністю замінив інсулін, отриманий з тваринних джерел (наприклад, свиней і великої рогатої худоби) для лікування інсулінозалежного діабету. Рекомбінантний інсулін синтезується шляхом введення гена людського інсуліну в бактерії роду етерихій або дріжджі.

Гормон росту

Призначається пацієнтам, у яких гіпофіз генерує недостатню кількість гормону зростання для підтримання нормального розвитку. До того, як рекомбінантний гормон росту став доступним, його отримували з гіпофіза трупів. Ця небезпечна практика призвела до того, що у деяких пацієнтів розвинулася хвороба Крейтцфельда-Якоба.

Рекомбінантний фактор згортання крові

Це згортаючий кров білок, який вводять пацієнтам з формами гемофілії з порушенням згортання крові. Вони не здатні продукувати фактор VIII в достатніх кількостях. До розробки рекомбінантного фактора VIII білок отримували шляхом обробки великої кількості крові людини від кількох донорів. Це спричинило дуже високий ризик передачі інфекційних захворювань.

Діагностика зараження ВІЛ

Кожен з трьох широко використовуваних методів діагностики ВІЛ-інфекції був розроблений з використанням рекомбінантної ДНК. Тест на антитіла використовує її білок. Він визначає наявність генетичного матеріалу ВІЛ за допомогою полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією. Розробка тесту стала можливою завдяки молекулярному клонуванню та аналізу послідовності геномів ВІЛ.