Рекомбінантний білок: методи отримання та застосування

Білок є важливим компонентом усіх організмів. Кожна його молекула складається з одного або декількох поліпептидних ланцюгів, що складаються з амінокислот. Хоча інформація, необхідна для життя, кодується ДНК або РНК, рекомбінантні білки виконують широкий спектр біологічних функцій в організмах, включаючи ферментативний каталіз, захист, підтримку, Рух та регуляцію. За своїми функціями в організмі ці речовини можна розділити на різні категорії, такі як антитіла, ферменти, структурний компонент. З огляду на важливі функції такі сполуки інтенсивно вивчалися і широко застосовувалися.

У минулому основним способом отримання рекомбінантного білка було його виділення з природного джерела, що, як правило, неефективно і забирає багато часу. Останні досягнення біологічних технологій молекул дозволили клонувати ДНК, що кодує певний набір речовин, у вектор експресії таких речовин, як бактерії, дріжджі, клітини комах та клітини ссавців.

Простіше кажучи, рекомбінантні білки транслюються продуктами екзогенної ДНК у живих клітинах. Їх отримання зазвичай містить два основних етапи:

1. Клонування молекули.
2. Експресія білка.

В даний час виробництво такої структури є одним з найпотужніших методів, що використовуються в медицині та біології. Склад має широке застосування в дослідженнях і біотехнології.

Медичний напрямок

Рекомбінантні білки забезпечують важливі методи лікування різних захворювань, таких як діабет, рак, інфекційні захворювання, гемофілія та анемія. Звичайні склади таких речовин включають антитіла, гормони, інтерлейкіни, ферменти та антикоагулянти. Існує зростаюча потреба в рекомбінантних складах для терапевтичного застосування. Вони дозволяють розширити методики лікування.

рекомбінантні білки, отримані за допомогою генної інженерії, відіграють ключову роль на ринку терапевтичних ліків. В даний час найбільше терапевтичних речовин продукується в клітинах ссавців, оскільки їх склади здатні виробляти високоякісні речовини, подібні природним. Крім того, багато затверджених рекомбінантних терапевтичних білків виробляються в кишковій паличці завдяки хорошій генетиці, швидкому зростанню та високопродуктивному виробництву. Це також несе позитивний ефект при розробці лікарських засобів на основі цієї речовини.

Проведення досліджень

Отримання рекомбінантних білків будується на різних методах. Речовини допомагають з`ясувати основні і фундаментальні принципи організму. Ці молекули можуть бути використані для ідентифікації та розташування речовини, кодованої певним геном, та для розкриття функції інших генів у різних клітинних активностях, таких як сигналізація клітин, метаболізм, ріст, реплікація та загибель, транскрипція, трансляція та модифікація складів, що розглядаються в роботі.

Таким чином, досліджуваний склад часто використовуються в молекулярній біології, клітинної біології, біохімії, структурних і біофізичних дослідженнях і багатьох інших областях науки. При цьому отримання рекомбінантних білків має міжнародну практику.

Такі склади є корисними інструментами в розумінні міжклітинних взаємодій. Вони довели свою ефективність у кількох лабораторних методах, таких як ІФА та імуногістохімія (IHC). Рекомбінантні білки можуть бути використані для розробки ферментних аналізів. При використанні в поєднанні з парою відповідних антитіл клітини можуть застосовуватися в якості стандартів, для застосування нових технологій.

Біотехнологія

Рекомбінантні білки, що містять амінокислотну послідовність, також використовуються в промисловості, виробництві продуктів харчування, сільському господарстві та біоінженерії. Наприклад, у тваринництві ферменти можуть додаватися в їжу, щоб підвищити поживну цінність кормових інгредієнтів, знизити витрати і відходи, підтримати здоров`я кишечника тварин, поліпшити продуктивність і поліпшити навколишнє середовище.

Крім того, молочнокислі бактерії (ЛАБ) довгий час використовувалися для виробництва ферментованих харчових продуктів, і недавно ЛАБ була розроблена для експресії рекомбінантних білків містять амінокислотну послідовність, які можуть знайти широке застосування, наприклад, для поліпшення травлення людини, тварин і харчування.

Однак такі речовини також мають обмеження:

1. У деяких випадках виробництво рекомбінантних білків є складним, дорогим і трудомістким.
2. Речовини, що продукуються в клітинах, можуть не збігатися з природними формами. Ця різниця може знизити ефективність терапевтичних рекомбінантних білків і навіть викликати побічні ефекти. Крім того, ця різниця може вплинути на результати експериментів.
3. Основною проблемою для всіх рекомбінантних препаратів є імуногенність. Всі біотехнологічні препарати можуть проявляти певну форму імуногенності. Важко передбачити безпеку нових терапевтичних білків.

Загалом, досягнення в галузі біотехнології збільшили та сприяли виробництву рекомбінантних білків для різних застосувань. Хоча вони все ще мають деякі недоліки, речовини важливі в медицині, дослідженнях та біотехнології.

Зв`язок з хворобами

рекомбінантний білок шкоду для людини не несе ніякої. Це лише складова частина загальної молекули при розробці конкретного препарату або елемента живлення. Багато медичних досліджень показали, що примусова експресія білка FGFBP3 (скорочено BP3) в лабораторному штамі мишей з ожирінням показала значне зниження їх жирової маси, незважаючи на генетичну схильність до вживання.

Результати таких дослідів показують, що білок FGFBP3 може запропонувати нову терапію для усунення порушень, пов`язаних з метаболічним синдромом, таких як діабет 2 типу і ожиріння печінки. Але оскільки BP3 є природним білком, а не штучним препаратом, клінічні випробування рекомбінантного людського BP3 можуть розпочатися після останнього раунду доклінічних досліджень. На, тобто причини пов`язані з безпекою проведення таких досліджень. Рекомбінантний білок шкода для людини не несе і через його ступінчастою обробки і очищення. Зміни відбуваються і на молекулярному рівні.

PD-L2, один з ключових гравців в імунотерапії, що знаходився в номінації Нобелівської премії з фізіології і медицині 2018 року. Ця робота, розпочата професором Джеймсом П. Аллісоном із США та професором Тасуку Хонджо з Японії, призвела до лікування раку, такого як меланома, рак легенів та інші, на основі імунотерапії контрольної точки. Нещодавно AMSBIO додав до своєї лінійки імунотерапії важливий новий продукт-активатор PD - L2 / TCR-SNO рекомбінантна клітинна лінія.

В експериментах з перевіркою концепції дослідники з Університету Алабами в Бірмінгемі під керівництвом доктора медичних наук Х.Лонг Чжен, професор Роберт Б. Адамса і директора відділу лабораторної медицини на кафедрі патології в школі UAB медицини, висунули на перший план потенційну терапію рідкісного, але смертельного порушення згортання крові, TTP.

Результати цього дослідження вперше демонструють, що переливання тромбоцитів, навантажених rADAMTS13, може бути новим і потенційно ефективним терапевтичним підходом до тромбозу артерій, пов`язаного з вродженим і імуноопосередкованим TTP.

Рекомбінантний білок - це не тільки поживна речовина, а й лікарський засіб у складі розроблюваного препарату. Це лише не багато напрямків, які зараз задіюються в медицині і відносяться до дослідження всіх його структурних елементів. Як показує міжнародна практика, структура речовини дає можливість на молекулярному рівні боротися з багатьма серйозними проблемами в організмі людини.

Розробка вакцин

Рекомбінантний білок-це певний набір молекул, які можна моделювати. Подібна властивість використовується і при розробці вакцин. Нова стратегія вакцинації, також відома як використання спеціальної рекомбінантної вірусної ін`єкції, може забезпечити захист мільйонів курей, яким загрожує серйозне респіраторне захворювання, повідомили дослідники з Університету Единбурга та Інституту Пірбрайта. Ці вакцини використовують нешкідливі або слабкі версії вірусу або бактерії для введення мікробів в клітини організму. У цьому випадку експерти використовували рекомбінантні віруси з різними білками спайків як вакцини для створення двох версій нешкідливого вірусу. Існує багато різних лікарських препаратів побудованих на це зв`язку.

Рекомбінантний білок торгові назви і аналоги має наступні:

1. "Фортелизин".
2. "Залтрап".
3. "Эйлеа".

В основному це протипухлинні препарати, але є й інші напрямки в лікуванні, пов`язані з цим активною речовиною.

Згідно з новим дослідженням, опублікованим у науковому журналі Nature Communications, нова вакцина, яка також називається LASSARAB, призначена для захисту людей як від лихоманки Ласса, так і від сказу, показала багатообіцяючі результати в доклінічних дослідженнях. Кандидат на інактивовану рекомбінантну вакцину використовує ослаблений вірус сказу.

Дослідницька група вставила генетичний матеріал вірусу Ласса у вектор вірусу сказу, щоб вакцина експресувала поверхневі білки як у Ласса, так і в клітинах сказу. Ці поверхневі склади викликають імунну відповідь проти збудників інфекцій. Потім така вакцина була інактивована для» знищення " живого вірусу сказу, використаного для виготовлення носія.

Методи отримання

Є кілька систем виробництва речовини. Загальний метод отримання рекомбінантного білка будується на отриманні з синтезу біологічного матеріалу. Але є й інші способи.

В даний час існує п`ять основних систем експресії:

1. Система експресії E. Coli.
2. Система експресії дріжджів.
3. Система експресії клітин комах.
4. Система експресії клітин ссавців.
5. Безклітинна система експресії білка.

Останній варіант особливо підходить для експресії трансмембранних білків і токсичних складів. В останні роки речовини, які важко експресувати звичайними внутрішньоклітинними способами, успішно інтегруються в клітини in vitro. У Білорусі отримання рекомбінантних білків отримало широке застосування. Є ряд державних підприємств, що займаються цим питанням.

Безклітинна система синтезу білка-це швидкий і ефективний метод синтезу речовин-мішеней шляхом додавання різних субстратів і енергетичних складів, необхідних для транскрипції і трансляції в ферментній системі клітинних екстрактів. В останні роки поступово з`являються переваги безклітинних методів таких типів речовин, як складні, токсичні мембранні, що демонструє їх потенційне застосування в біофармацевтичній області.

Безклітинна технологія може легко та контрольовано додавати різноманітні природні амінокислоти для досягнення складних процесів модифікації, які важко вирішити після звичайної рекомбінантної експресії. Подібні методи мають високу цінність для застосування і потенціал для доставки ліків і розробки вакцин з використанням вірусоподібних частинок. Велика кількість мембранних білків була успішно експресована у вільних клітинах.

Експресія складів

Рекомбінантний білок CFP10-ESAT 6 виробляється і застосовується для створення вакцин. Такий туберкульозний алерген дозволяє посилити імунітет і виробити антитіла. Загалом, молекулярні дослідження включають вивчення будь-якого аспекту білка, такого як структура, функція, модифікації, локалізація або взаємодії. Щоб дослідити, як конкретні речовини регулюють внутрішні процеси, дослідникам зазвичай потрібні засоби для виробництва функціональних сполук, що представляють інтерес та користь.

Враховуючи розмір і складність білків, хімічний синтез не є життєздатним варіантом для цього починання. Замість цього, живі клітини та їх клітинні механізми зазвичай використовуються як фабрики для створення і конструювання речовин на основі наданих генетичних шаблонів. Система експресії рекомбінантних білків надалі виробляє необхідну структуру для створення ліків. Далі відбувається відбір необхідного матеріалу для різної категорії препаратів.

На відміну від білків, ДНК легко конструювати синтетично або in vitro, використовуючи добре зарекомендували себе методи рекомбінантної. Отже, ДНК-матриці специфічних генів, з доданими репортерними послідовностями або послідовностями афінних міток або без них, можуть бути сконструйовані в якості матриць для експресії досліджуваного речовини. Такі склади, отримані з таких ДНК-матриць, і називаються рекомбінантними білками.

Традиційні стратегії експресії речовини включають трансфекцію клітин за допомогою ДНК-вектора, який містить матрицю, і подальше культивування клітин з тим, щоб вони транскрибували і транслювали бажаний білок. Зазвичай клітини потім лізують для екстракції експресованого складу для подальшого очищення. Білок рекомбінантний CFP10-ESAT6 обробляється таким чином і проходить систему очищення від можливого утворення токсинів. Тільки після цього він надходить для синтезування у вакцину.

Як прокаріотичні, так і еукаріотичні системи експресії молекулярних речовин in vivo широко використовуються. Вибір системи залежить від типу білка, вимог до функціональної активності і бажаного виходу. Ці системи експресії включають ссавців, комах, дріжджів, бактерій, водоростей та клітин. У кожної системи є свої переваги і проблеми, і вибір правильної системи для конкретного застосування важливий для успішної експресії досліджуваного в статті речовини.

Експресія з ссавців

Застосування рекомбінантних білків дозволяє розробляти вакцини і ліки різного рівня. Для цього може бути задіяний цей метод отримання речовини. Системи експресії ссавців можуть бути використані для продукування білків з тваринного світу, які мають найбільш нативну структуру і активність завдяки своєму фізіологічно релевантному середовищу. Це призводить до високого рівня посттрансляційної обробки та функціональної активності. Системи експресії ссавців можуть бути використані для виробництва антитіл, складних білків і сполук для використання в функціональних аналізах на основі клітин. Проте, ці переваги в поєднанні з більш жорсткими умовами культури.

Системи експресії ссавців можуть бути використані для отримання білків тимчасово або через стабільні клітинні лінії, де конструкція експресії інтегрована в геном господаря. Хоча такі системи можуть бути використані в декількох експериментах, тимчасове виробництво може генерувати велику кількість речовини за один-два тижні. Біотехнологія рекомбінантних білків такого типу користується високим попитом.

Ці перехідні, високопродуктивні системи експресії ссавців використовують суспензійні культури і можуть давати вихід грам на літр. Крім того, ці білки мають більше нативного складання та посттрансляційних модифікацій, таких як глікозилювання, порівняно з іншими системами експресія.

Експресія з Комахи

Методи отримання рекомбінантного білка не обмежуються тільки ссавцями. Є і більш продуктивні способи в плані вартості виробництва, хоч і виходу речовини на 1 літр оброблюваної рідини значно нижче.

Клітини комах можуть бути використані для експресії білка високого рівня з модифікаціями, подібними до систем ссавців. Існує кілька систем, які можна використовувати для отримання рекомбінантного бакуловірусу, який потім можна застосовувати для вилучення речовини, що представляє інтерес, у клітинах комах.

Експресії рекомбінантних білків можуть бути легко розширені і адаптовані до суспензійної культури високої щільності для великомасштабного отримання з`єднання молекул. Вони більш функціонально схожі на нативний склад речовини ссавців. Хоча вихід може становити до 500 мг / л, виробництво рекомбінантного бакуловірусу може займати багато часу і умови культивування більш складні, ніж прокаріотичні системи. Однак в більш південних і теплих країнах подібний метод вважається більш ефективним.

Бактеріальна експресія

Виробництво рекомбінантних білків може бути налагоджено і за допомогою бактерій. Ця технологія набагато відрізняється від описаних вище. Системи експресії бактеріального білка популярні, тому що бактерії легко культивуються, швидко ростуть і дають високі виходи рекомбінантного складу. Однак мультидоменні еукаріотичні речовини, експресовані в бактеріях, часто є нефункціональними, оскільки клітини не обладнані для виконання необхідних посттрансляційних модифікацій або молекулярного згортання.

Крім того, багато білків стають нерозчинними у вигляді молекул включення, які дуже важко відновити без жорстких денатураторів і подальших громіздких процедур рефолдингу молекулярного складу. Такий метод здебільшого вважається ще багато в чому експериментальним.

Безклітинна експресія

Рекомбінантний білок містить амінокислотну послідовність стафілокінази виходить дещо іншим шляхом. Він входить до складу багатьох видів ін`єкцій, від чого потрібно кілька систем перед використанням.

Безклітинна експресія білка являє собою синтез речовини in vitro з використанням сумісних з трансляцією екстрактів цілих клітин. В принципі, цілі клітинні екстракти містять усі макромолекули та компоненти, необхідні для транскрипції, трансляції і навіть посттрансляційної модифікації.

Ці компоненти включають РНК-полімеразу, регуляторні білкові фактори, форми транскрипції, рибосоми та тРНК. При додаванні кофакторів, нуклеотидів та специфічної матриці генів ці екстракти можуть синтезувати цікаві білки за кілька годин.

Хоча вони не є стійкими для великомасштабного виробництва, безклітинні системи або системи експресії білка in vitro (IVT) мають ряд переваг перед традиційними системами in vivo.

Безклітинна експресія дозволяє швидко синтезувати рекомбінантні склади без залучення клітинної культури. Безклітинні системи дозволяють мітити білки модифікованими амінокислотами, а також експресувати склади, які піддаються швидкій протеолітичній деградації внутрішньоклітинними протеазами. Крім того, за допомогою безклітинного методу простіше одночасно експресувати багато різних білків (наприклад, тестувати мутації білка шляхом експресії в невеликому масштабі з безлічі різних матриць рекомбінантних ДНК). У цьому репрезентативному експерименті для експресії білка каспази-3 людини використовували систему IVT.

Висновки та перспективи на майбутнє

Виробництво рекомбінантного білка тепер можна розглядати як зрілу дисципліну. Це результат численних поступових поліпшень в очищенні та аналізі. В даний час програми відкриття ліків рідко зупиняються через неможливість продукувати цільовий білок. Паралельні процеси експресії, очищення та аналізу декількох рекомбінантних речовин в даний час добре відомі в багатьох лабораторіях по всьому світу.

Білкові комплекси та зростаючий успіх у створенні солюбілізованих мембранних структур потребуватимуть більше змін, щоб не відставати від попиту. Поява ефективних контрактних дослідницьких організацій для більш регулярного постачання білків дозволить перерозподілити ресурси науки для вирішення цих нових завдань.

Додатково, паралельні робочі процеси повинні дозволяти створювати повні бібліотеки досліджуваної речовини, щоб забезпечити можливість ідентифікації нових цілей і розширеного скринінгу, поряд з традиційними проектами з виявлення ліків на основі малих молекул.